蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳简介

几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。最常用的方法是将强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。在达到饱和的状态下，每克多肽约可结合1.4克去污剂，借助已知分子量的标准参照物，则可测算出多肽链的分子量云南絮凝剂聚丙烯酰胺厂家。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液，当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品中所含的SDS多肽复合物向前推进。样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。曲于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率。

最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornsstein(1964)和Davis(1964)设计的，样品和积层胶中含Tris-Cl(pH6.8)，上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH8.3)，分离胶中含Tris-Cl(pH8.8)的。系统中所有组分都含有0.1%的SDS(Laemmli,1970)，样品和积层胶中的氯离干形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域，它推动样品中的多肽前移并在分离胶前沿积聚，此处pH值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的多肽并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS多肽复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。

材料

分离胶及积层胶溶液

水饱和异丁醇 1×Tris・Cl/SDS,

pH8.8 蛋白质分子量标准混合物

1×SDS电泳缓冲液

电泳装置及夹子、玻璃板、灌胶支架、缓冲液槽等附件 0.75mm封边垫片 0.75mm样品梳子 50μl微量进样器 恒流电源

试剂配置

1）30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺

将30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中，加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。0.45μm微孔滤膜过滤除菌，查证该溶液pH应不大于7.0，置棕色瓶中保存。 小心：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。

2）4×Tris・Cl/SDS,pH8.8

在300mlH2O中溶解91g Tris碱(1.5mol/L)，用1mol/L调节pH至8.8,补加H2O至体积500ml。用0.45μm滤膜过滤溶液，再加入2g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。

3）4×Tris・Cl/SDS,pH6.8

在40mlH2O中溶解6.05g Tris碱(0.5mol/L)，用1mol/L调节pH至6.8,补加H2O至体积100ml。用0.45μm滤膜过滤溶液，再加入0.4g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。

4）4×SDS电泳缓冲液

Tris base 24.2 g Glycerin 115.3 g 20%SDS 20 ml 加水至总体积1000ml。 应用时稀释4倍即为1×SDS电泳缓冲液(Tris 0.05M,Glycerin 0.38M,SDS 0.1%)。

5）TEMED (N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)

TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺的聚合。

6）10%过硫酸铵

过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和亚甲丙烯酰胺聚合所必需的自由基。可用去离子水配制小量10%(w/v)的贮存液并保存于4℃。由于过硫酸铵会缓慢分解，故应隔周新鲜配制。

操作过程

1）按电泳使用指南用两块干净的玻璃，平板和0.75mm垫片组装电泳装置中的玻璃平板夹层，并固定在灌胶支架上。

2）按表7.1配制分离胶液体并脱气，然后加入10%的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌混匀。

聚丙烯酰胺分离胶的配制 试剂成分 配制不同浓度分离胶所需试剂(ml) 5% 8% 10% 12% 15% Acry:Bis (30:0.8) 2.50 4.00 5.00 6.00 7.50 4×Tris・Cl/SDS,pH8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 H2O 8.75 7.25 6.25 5.25 3.75 10%过硫酸铵 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 按所需分离的蛋白质分子大小选择合适的丙烯酰胺百分比浓度，一般地，5%的凝胶可用于60～200kDa的SDS变性蛋白质分子的分离，10%用于16～70kDa，15%用于12～45kDa。

3）用一根巴斯德吸管立即将分离胶液体沿夹层中一条垫片的边缘加入于玻璃平板夹层中，至凝胶约5cm高为止。样品体积少于10μl不需灌制积层胶。

4）用另一根已斯德吸管，先从一边的垫片，再从另一边垫片往夹层的液面顶部缓缓加入一层水饱和异丁醇（厚约1cm）。让凝胶在室温聚合30min。 聚合后，可见在顶层异丁醇与凝胶的界面间有一清晰的折光线，胶的聚合失败往往问题在于过硫酸按或TEMED，或两者都有。

5)倾去顶层的异丁醇，并以1×Tris-Cl/SDS,pH8.8缓冲液冲洗凝胶的顶部表面,尽量用吸水纸吸干昆明聚丙烯酰胺。

6)按表7.2配制积层胶液体，用吸管将液体沿一条垫片加入到玻璃平板夹层，直至夹层的顶部。 聚丙烯酰胺积层胶的配制 GEL%（3.9%） Total (10.05ml) Acry:Bis(30:0.8) 1.30 ml 4×Tris・Cl/SDS,pH6.8 2.50 ml H2O 6.10 ml 10%过硫酸铵 0.05 ml TEMED 0.01 ml

7)将0.75mm厚的梳子插入夹层的积层胶液体中，必要时，再补加积层胶液体充盈剩余空间。让积层胶室温聚合30min。

8)在具螺口盖的微量离心管中，用2×SDS加样缓冲液按1:1(v/v)稀释待测蛋白质样品，于100℃煮沸5-10min。如样品是蛋白质沉淀物，加入50～100μl 1×SDS加样缓冲液溶解之，并同样在100℃煮沸5-10min。按供应商的使用指南用2×SDS加样缓冲液溶解蛋白质分子量标准混合物。 对于0.3cm宽的加样孔，推荐加样体积以不超过20μl 为宜。用考马斯亮蓝染色法显迹，成分很复杂的蛋白质混合物需加25～50μg，而样品中只有一种或不多的几种蛋白的话，只需1～10μg蛋白量。采用银染显迹时，样品用量可减小10～100倍（按样品的复杂程度在小于20μl的体积溶有0.01～0.5ng蛋白样品不等）。 2×SDS加样缓冲液(loading buffer)配制： 成分 体积(ml) 0.5M Tris・Cl (pH6.8) 12.5 20%SDS 11.5 Glycerin 10 2% Blue-Bromo-phenol 2.5 β-mercaptoethanol * 5.0 加H2O至总体积50 ml，分装 *β-mercaptoethanol 在临用前加入。

9）小心拔出梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝胶加样孔。取出梳子后，以1×SDS电泳电泳缓冲液冲洗加祥孔，并以此缓冲液充满之。

10）按厂商指南将凝胶板固定到电泳装置的上缓冲液室（上槽），同时往下缓冲液室（下槽）加入推荐量的1×SDS电泳缓冲液。

11）将固定于上槽的凝胶板放入下槽中，并往上槽加入部分电泳缓冲液至刚好淹没凝胶的加样孔。

12）用带平嘴针头的50μl注射器将同样浓度的蛋白质样品等体积加入到样品孔中，小心加样使样品在孔的底部成一薄层，对照孔加入蛋白质分子量标准样品，如有空置的加样孔，须加等体积的空白1×SDS样品缓冲液，以防相邻泳道样品的扩散。

13)再往上槽加入余下的1×SDS电泳缓冲液。此操作缓慢小心，以防冲起样品孔中的样品。

14）连接电源，对于0.75mm厚的垂直板电泳，先在60V下电泳至溴酚蓝染料从积层胶进入分离胶，再将电压调至120V继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止。 15）关闭电源并撤去连接的导线，弃去电泳缓冲液。连同上槽一起将凝胶夹层取出。

16）将凝胶定位以便识别加样的顺序，将凝胶板从上槽解离出来，放在一叠吸水纸或纸巾上。

17）小心将封边的垫片抽出一半，并以此为杠杆橇起上面的玻璃平板，使凝胶暴露出来。

18）小心从下面的玻璃平板上移出凝胶，在凝胶的一角切去一小块以便在染色及干胶后仍能认出加样次序，接着就可进行蛋白质的检测云南聚丙烯酰胺价格。